CRISPR/Cas-Verfahren

Woher kommt das Ver­fah­ren CRISPR/Cas9

Die CRISPR/Cas9 Tech­nik basiert auf einem natür­li­chen Abwehr­me­cha­nis­mus, der bei Bak­te­ri­en vor­kommt. Bak­te­ri­en spei­chern in ihrem Genom kur­ze DNA-Sequen­zen der Viren, die sie infi­zie­ren. Die­se sich wie­der­hol­ten­den DNA-Abschit­te wer­den als CRISPR (Clu­ste­red Regu­lar­ly Inter­spa­ced Short Palin­dro­mic Repeats) bezeich­net. Kommt es zu einer erneu­ten Infek­ti­on mit dem­sel­ben Virus, erkennt dies das Bak­te­ri­um und kann sich dage­gen weh­ren.

Wie funk­tio­niert CRISPR/Cas9

Bak­te­ri­en tran­skri­bie­ren CRISPR, die­se kur­zen Sequen­zen der vira­len DNA, regel­mä­ßig in RNA-Mikro­se­quen­zen. So ent­ste­hen Kopien von Frag­men­ten des Genoms der Viren. Tref­fen sol­che RNA-Kopien auf das Ori­gi­nal­vi­rus in der Zel­le, wird das Virus erkannt und die RNA bin­det an die iden­ti­sche, homo­lo­ge vira­le Sequenz. Dies ermög­licht es dem Pro­te­in Cas9, das vira­le Genom zu zer­schnei­den und so unschäd­lich zu machen. Kurz gesagt, ist Cas9 ein mole­ku­la­rer Meis­sel oder eine Sche­re, wel­che die DNA am Punkt schnei­det, an dem eine RNA-Kopie von CRISPR bin­det. Der genaue Mecha­nis­mus wur­de erst 2012 ver­stan­den und für die Bio­tech­no­lo­gie nutz­bar gemacht.

Die Wis­sen­schaft­ler inter­es­sier­ten sich vor allem für die Fähig­keit der mole­ku­la­ren Sche­re Cas9, die DNA an einem ganz bestimm­ten Ort, der durch die Über­ein­stim­mung mit der RNA ermit­telt wird, zu schnei­den. In der bio­tech­no­lo­gi­schen Anwen­dung wird eine Gui­de-RNA (gRNA), die mit der Sequenz eines gesuch­ten Gens iden­tisch ist, syn­the­tisch her­ge­stellt und zusam­men mit dem Pro­te­in Cas9 in eine Zel­le ein­ge­bracht. Die­se gRNA erkennt die DNA-Sequenz im Genom der Pflan­zen­zel­le durch Homo­lo­gie und bin­det die­se Sequenz. Das Pro­te­in Cas9 erkennt die­se RNA-DNA-Ver­bin­dung und schnei­det die DNA. Die­se Schnitt­stel­le in der DNA wird dar­auf­hin genutzt, um Muta­tio­nen zu erzeu­gen, gene­ti­sche Sequen­zen unter­schied­li­cher Län­ge ein­zu­fü­gen oder zu ent­fer­nen. Dies geschieht zum Teil durch natür­li­che Repa­ra­turme­cha­nis­men der Zel­len.

Der genaue Mecha­nis­mus wur­de erst 2012 ent­deckt und für die Bio­tech­no­lo­gie nutz­bar gemacht. Dazu wird die ursprüng­li­che Funk­ti­ons­wei­se die­ses bak­te­ri­el­len Abwehr­sy­stems imi­tiert, um die DNA an einer bestimm­ten Stel­le zu zer­schnei­den. Dazu wird eine soge­nann­te Gui­de-RNA (gRNA), wel­che iden­tisch mit der gewünsch­ten Gen-Sequenz ist, syn­the­ti­siert und zusam­men mit dem Cas-Pro­te­in in eine Zel­le ein­ge­bracht. Dazu kom­men meist die kon­ven­tio­nel­len gen­tech­ni­schen Metho­den zum Ein­satz, das heisst das Gen­kon­strukt wird mit einer Gen­ka­no­ne oder mit­tels eines Vek­tors in die Zel­le ein­ge­schleust.
Danach dockt die Gui­de-RNA die gesuch­te DNA-Sequenz an und das Cas9 Pro­te­in schnei­det bei­de DNA-Strän­ge durch (Dop­pel­strang­bruch). Die­se Schnitt­stel­le wird dar­auf­hin mit den zel­lu­lä­ren Repa­ra­turme­cha­nis­men repa­riert.

Die­se Mög­lich­keit, mit CRISPR/Cas9 effi­zi­ent DNA-Sequen­zen anzu­steu­ern und zu schnei­den, ist für die Bio­tech­no­lo­gie ent­schei­dend. Die­se Schnit­te wer­den ver­wen­det, um Muta­tio­nen zu erzeu­gen, mehr oder weni­ger lan­ge gene­ti­sche Sequen­zen ein­zu­fü­gen oder aber zu ent­fer­nen. Das CRIS­PR/­Cas-System hat die Bio­tech­no­lo­gie revo­lu­tio­niert, weil es viel ein­fa­cher und schnel­ler zu ent­wickeln ist als ver­wand­te Tech­ni­ken. Und dies zudem noch sehr viel bil­li­ger.

Unter­schie­de zwi­schen kon­ven­tio­nel­len Metho­den der Gen­tech­nik und CRISPR/Cas9

Die Unter­schie­de zwi­schen Genom-Ver­än­de­run­gen mit CRISPR/Cas9 und der kon­ven­tio­nel­len Gen­tech­nik sind nicht für alle Orga­nis­men gleich. All­ge­mein kann gesagt wer­den:  

• Bei kon­ven­tio­nel­len gen­tech­ni­schen Metho­den ist die Stel­le, an der das Genom ver­än­dert wird, in der Regel zufäl­lig. Mit CRISPR/Cas9 erfolgt die Modi­fi­ka­ti­on an einer vor­de­fi­nier­ten Sequenz des Genoms.
• Die CRIS­PR/­Cas-Tech­nik erlaubt es nicht nur, dem Genom neue Gene hin­zu­zu­fü­gen, son­dern es kön­nen auch bestehen­de Gene gezielt deak­ti­viert, modi­fi­ziert oder eli­mi­niert wer­den.
• Mit CRISPR/Cas9 ist es mög­lich, meh­re­re spe­zi­fi­sche Stel­len des Genoms gleich­zei­tig zu modi­fi­zie­ren (Mul­ti­plex­ing).
• Bei Orga­nis­men (Tie­re, Insek­ten, Men­schen, Pil­ze), deren Genom mit kon­ven­tio­nel­len gen­tech­ni­schen Metho­den kaum ver­än­dert wer­den kann, wird CRISPR/Cas9 künf­tig Ein­grif­fe ins Genom ver­ein­fa­chen.

Risi­ken und Genau­ig­keit von CRISPR/Cas9


Es wird immer wie­der her­vor­ge­ho­ben, das CRIS­PR-System sei prä­zi­ser als ande­re Tech­ni­ken. Trotz­dem kann es mit CRISPR/Cas9 zu unge­woll­ten feh­ler­haf­ten Effek­ten (off-tar­get) kom­men. Die­se tre­ten auf, wenn das Pro­te­in Cas9 von der gRNA an eine fal­sche Stel­le, aus­ser­halb der vor­ge­se­he­nen Ziel­re­gio­nen des Genoms gelei­tet wird und dort den DNA-Strang durch­trennt. Zudem schnei­det CRISPR/Cas9 auch bei einer unge­fäh­ren Über­ein­stim­mung zwi­schen der gRNA und der zu schnei­den­den DNA-Sequenz.

Es muss daher durch ein ange­mes­se­nes Risi­ko­be­wer­tungs­ver­fah­ren im Rah­men der Regu­lie­rung die­ser Tech­ni­ken sicher­ge­stellt wer­den, dass sol­che unge­woll­ten Effek­te nicht statt­fin­den. Denn klein­ste Muta­tio­nen kön­nen — auch bei weni­gen Off-Tar­get-Effek­ten — gra­vie­ren­de Aus­wir­kun­gen haben. So beruht bei­spiels­wei­se die Hämo­phi­lie A (Blu­ter­krank­heit) auf einer ein­zi­gen Muta­ti­on in einem Gen, das für einen Gerin­nungs­fak­tor kodiert.

Hin­zu kommt, dass die soge­nann­te Genom-Edi­tie­rung immer ver­bun­den ist mit der Ein­füh­rung der Bau­stei­ne Cas9 und einer gRNA in eine Zel­le. Die trans­for­mier­ten Zel­len wer­den anschlie­ßend in-vitro kul­ti­viert. Jeder die­ser zwei Pro­zes­se kann zu unbe­ab­sich­tig­ten Ver­än­de­run­gen des Genoms füh­ren.

Die Genau­ig­keit des CRIS­PR/­Cas9-Systems hängt immer auch von der Sorg­falt der Durch­füh­ren­den ab. Durch die Ver­suchs­an­ord­nung kann das Aus­mass der unge­woll­ten Modi­fi­ka­tio­nen beein­flusst wer­den.

Daher ist es not­wen­dig, Kon­troll­ver­fah­ren ein­zu­füh­ren, um sicher­zu­stel­len, dass sol­che Neben­wir­kun­gen nicht auf­tre­ten, und eine ange­mes­se­ne Risi­ko­be­wer­tung im Rah­men der Regu­lie­rung die­ser Tech­ni­ken vor­zu­se­hen.

Unsi­cher­hei­ten bei CRISPR/Cas9


Unsi­cher­heit bezeich­net das, von dem wir wis­sen, dass wir es nicht wis­sen, aber auch alles, von dem wir nicht wis­sen, dass wir es nicht wis­sen. Unser Wis­sen über das Genom und sei­ne Funk­ti­ons­wei­se ist noch immer sehr dürf­tig. Zur Erin­ne­rung: Gene machen nur 2% des Genoms aus. Die genaue Rol­le der rest­li­chen 98% der DNA ist nicht genau bekannt! Das Genom ist kei­ne sta­ti­sche Ein­heit, die nur aus einem Code besteht, der modi­fi­ziert wer­den kann, ohne dass die­ser Modi­fi­ka­ti­ons­pro­zess ande­re Reak­tio­nen aus­löst. Viel­mehr ist das Genom eine Ein­heit, wel­che mit Selbst­or­ga­ni­sa­ti­on, Selbst­re­gu­lie­rung und Selbst­an­pas­sung aus­ge­stat­tet ist — in stän­di­ger Bezie­hung zur ent­spre­chen­den Umwelt. Von Prä­zi­si­on zu spre­chen, ist unver­ant­wort­lich, solan­ge wir nicht ver­stan­den haben, wie Geno­me funk­tio­nie­ren, sich selbst orga­ni­sie­ren und ent­wickeln. Auch zu den genau­en Funk­ti­ons­wei­sen von CRISPR/cas9 und den DNA-Repa­ra­tur­sy­ste­men bestehen Wis­sen­lücken. Man kann sie zwar anwen­den, doch was genau vor sich geht, ver­steht die Wis­sen­schaft im Detail noch nicht. Dar­um ist es unab­ding­bar, dass CRISPR/Cas9 als Gen­tech­nik ein­ge­stuft wird und damit dem Gen­tech­nik-Gesetz unter­stellt wird.